Gli Organismi Geneticamente Modificati (OGM), risultano essere la conseguenza diretta ed immediata della biotecnologia innovativa applicata. Sono prodotti mediante l’impiego di tecniche di ingegneria genetica che permettono l’aggiunta di nuovi geni o il cambiamento di geni già esistenti nell’organismo oggetto della modifica. Infatti, in base alla Direttiva 2001/18/CE, che regola il rilascio ambientale degli OGM, si identifica come tale “un organismo, diverso da un essere umano, il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale”. Poiché questa modifica viene definita “trasformazione” o “transgenesi” l’organismo che da esso ne deriva viene detto “trasformato” o “transgenico”.

Le modificazioni che avvengono in natura mediante incrocio e/o mediante ricombinazione genetica naturale richiedono tempi lunghi e permettono di ottenere le combinazioni migliori di caratteristiche già presenti in natura seppur non permettendo il trasferimento di un singolo tratto genico da un individuo ad un altro o la scelta di trasferire a piacimento un determinato carattere. Diversamente, grazie alle procedure di ingegneria genetica è possibile intervenire su piante o animali introducendo o eliminando caratteristiche in modo mirato e preciso. Infatti, individuato il gene con la caratteristica d’interesse, la sequenza di DNA è inserita grazie all’azione di particolari enzimi all’interno di un vettore che sarà in grado, a sua volta, di trasferire il gene “estraneo” nelle cellule dell’organismo da modificare (Figura 1). Considerando che il risultato finale di una modificazione genetica si basa su processi che sono controllati da più geni e che la funzione esplicata da molti geni è ancora ignota o poco conosciuta, è necessario disporre di metodi univoci al fine di identificare e caratterizzare gli eventuali effetti a livello genomico, proteomico e matabolomico.

Figura 1. Confronto tra il metodo convenzionale di miglioramento genetico (A) e tecniche di Ingegneria Genetica (B).

La ricerca e lo sviluppo degli OGM hanno interessato, nel corso degli anni, numerosi settori tra loro molto diversi. In particolare, negli ultimi decenni le biotecnologie hanno avuto un ruolo rilevante nel settore agro-alimentare e ambientale. In campo agricolo l’uso degli OGM mira ad ottenere nuove varietà di piante coltivate con caratteristiche migliorate quali, ad esempio, resistenza a patogeni e parassiti, tolleranza ad erbicidi, resistenza a stress ambientali e aumento della produttività. In campo alimentare le tecniche di ingegneria genetica tendono a migliorare le caratteristiche nutrizionali dei cibi, aumento della shelf life dei prodotti nonché migliorarne le caratteristiche organolettiche e sensoriali. Diversamente l’uso di microrganismi modificati risultano rappresentare una promessa in campo ambientale per disinquinare ad esempio il suolo e le acque inquinate da composti tossici.

Nel 2016, dopo alcuni anni di riduzione, le superfici coltivate con varietà geneticamente modificate sono tornate a crescere sia nell’Unione Europea che a livello mondiale. Infatti, secondo l’Isaaa (Iternational Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications) nel 2016 sono state coltivate nel mondo 185,1 milioni di ettari a OGM rispetto ai 179,7 milioni del 2015, registrando un incremento del 3% (Figura 2).

Figura 1. ISAAA. 2016. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016. ISAAA Brief N° 52. ISAAA: Ithaca, NY.

Pertanto, con un mercato alimentare sempre più globalizzato e viste le differenze normative esistenti tra i vari paesi circa l’uso degli OGM, si evidenzia una crescente esposizione del mercato alimentare a rischio di contaminazione da prodotti biotech commercializzati in altri Stati ma non autorizzati all’interno dell’Unione Europea. Per questi motivi l’unità di biologia molecolare del laboratorio di analisi C.A.I.M. è in grado di eseguire il controllo degli OGM su matrici alimentari al fine di soddisfare sia gli operatori del settore che richiedono analisi sempre più rapide e affidabili sia le esigenze dei consumatori caratterizzate sempre più da una crescente importanza assegnata alle caratteristiche sia dei processi produttivi degli alimenti che dei prodotti finali. In particolare, il laboratorio C.A.I.M. offre ai propri clienti la possibilità di individuare la presenza di OGM mediante screening qualitativo ad ampio spettro di target analitici quali 35S, NOS, FMV, BAR, NPTII, PAT, CTP2:CP4 EPSPS al fine di assicurare la migliore copertura dei possibili eventi OGM (Tabella 1). La tecnologia analitica impiegata si basa sull’uso di metodiche in Real Time PCR che permettono di evidenziare in maniera specifica e sensibile la presenza di organismi geneticamente modificati al fine di verificare il rispetto dei requisiti di legge.

Tabella 1. La tabella mostra alcuni degli eventi OGM che possono essere individuati mediante screening qualitativo in Real Time PCR.

La legislazione nazionale e comunitaria in materia di OGM è il frutto di una linea di prudenza iniziata negli anni ‘90, coerente con quanto emerso nei dibattiti pubblici che hanno preceduto e accompagnato la sua emanazione, che nel corso degli anni si è progressivamente evoluta e modificata. Dal 2001, la direttiva 2001/18/CE stabilisce la procedura di autorizzazione per l’immissione deliberata di OGM nell’ambiente per fini diversi dalla commercializzazione (ossia a scopo sperimentale) e per l’immissione in commercio di OGM. Tale direttiva è stata recepita in Italia con il decreto legislativo 8 luglio 2003, n° 224. Più tardi, nel 2003, sono stati emanati i regolamenti (CE) n° 1829/2003 e n° 1830/2003 che costituiscono in Europa le normative di riferimento circa le procedure per l’autorizzazione, l’etichettatura e la tracciabilità di alimenti e mangimi. Recentemente, la direttiva 2015/412/UE del Parlamento Europeo e del Consiglio che modifica la direttiva 2001/18/EC conferisce agli Stati membri la possibilità di limitare o vietare in tutto il territorio o in parte di esso la coltivazione di un OGM o di un gruppo di OGM in fase di autorizzazione o già autorizzati a livello europeo. In particolare, per quanto riguarda il processo di autorizzazione, il regolamento (CE) n° 1829/2003 si sovrappone alla direttiva 2001/18/CE e in parte la modifica ma non la abroga e descrive le informazioni che vanno fornite al fine di ottenere l’autorizzazione di immissione di un prodotto sul mercato. In particolare, la norma si applica a OGM destinati all’alimentazione umana, alimenti che contengono o sono costituiti da OGM, alimenti che sono prodotti a partire da o che contengono ingredienti prodotti a partire da OGM. Tali alimenti:

• non devono avere effetti nocivi per la salute umana e animale e per l’ambiente;
• non devono trarre in inganno i consumatori;
• non devono differire dagli alimenti che intendono sostituire in misura tale che il loro consumo normale sarebbe svantaggioso per i consumatori sul piano nutrizionale;
• deve contenere OGM tracciabili durante tutti i passaggi di produzione e distribuzione.

Il prodotto deve essere approvato dall’Agenzia Europea per la Sicurezza degli Alimenti (EFSA), dalla Commissione Europea nonché dagli Stati membri. Pur non essendo stata abrogata la direttiva 2001/18/CE, attualmente i richiedenti l’autorizzazione per l’immissione di alimenti e mangimi geneticamente modificati segue la procedura descritta dal regolamento (CE) n° 1829/2003, diversamente per le sperimentazioni viene utilizzata quella descritta dalla direttiva 2001/18/CE.

Relativamente all’etichettatura e la tracciabilità, i regolamenti (CE) n° 1829/2003 e n° 1830/2003 stabiliscono che:

• sul territorio dell’Unione Europea possono essere immessi sul mercato solo eventi autorizzati da decisione comunitaria;
• alimenti e mangimi che contengono o sono prodotti da OGM autorizzati devono essere etichettati come “geneticamente modificati” o “prodotti da un ingrediente geneticamente modificato”;
• l’indicazione in etichetta non è richiesta per alimenti che contengono OGM autorizzati, oppure sono costituiti o prodotti da OGM autorizzati in proporzione non superiore allo 0,9% degli ingredienti, purché tale presenza sia accidentale o tecnicamente inevitabile. L’etichettatura è quindi obbligatoria per alimenti e mangimi contenenti più dell’1% di OGM.

Pertanto, gli Organismi Geneticamente Modificati sono regolati da un quadro normativo che non ha eguali nel settore alimentare e quindi soggetti a maggiori controlli rispetto ad altri prodotti alimentari. Infatti, risultano essere difficilmente evitabili contaminazioni accidentali ed involontarie di materiale geneticamente modificato nel corso della coltivazione, manipolazione, stoccaggio e trasporto degli alimenti immessi in commercio all’interno dell’Unione Europea. In particolare, considerando il numero sempre più crescente di eventi geneticamente modificati autorizzati e non che devono essere ricercati, il sistema di screening multiplo offerto dal laboratorio di analisi C.A.I.M. risulta essere uno strumento essenziale al fine di fornire le corrette informazioni sulla conformità/non conformità dei campioni. Ad una eventuale positività riscontrata in fase di screening, si dovrà procedere nella ricerca degli eventi geneticamente modificati che risultano essere compatibili con i risultati dello screening. Di conseguenza, nel caso in cui venga confermata la presenza di eventi geneticamente modificati che possono essere immessi sul territorio europeo, contenuti nel Registro Comunitario, si deve procedere alla relativa quantificazione al fine di verificare i requisiti di tracciabilità e di etichettatura previsti al di sopra della soglia dello 0,9%. La sola analisi quantitativa risulta essere sufficiente solo nel caso di OGM non autorizzati dall’Unione Europea, in quanto per loro non è prevista alcuna soglia di tolleranza.

Il laboratorio analisi C.A.I.M. è in grado di offrire ai propri clienti approcci differenti per la ricerca e conta di Brettanomyces.
Il primo approccio, di tipo coltura-dipendente, prevede l’utilizzo di terreni solidi selettivi che possono essere impiegati mediante tecniche di semina del campione o per filtrazione del campione stesso su membrane che successivamente vengono posizionate sul terreno di coltura.

Recentemente, diversi autori hanno investigato circa la possibilità di contaminazione da parte di Brettanomyces spp. proveniente dall’aria.
Seppur la maggior parte dei lieviti isolati appartengono al gruppo dei non-Saccharomyces come ad esempio specie appartenente al genere Sporidiobolus e Cryptococcus, alcuni ricercatori hanno evidenziato la presenza di Brettanomyces/Dekkera in alcune aree predisposte alla vinificazione, dimostrando che anche l’aria può essere veicolo di contaminazione. Per questo motivo, il laboratorio C.A.I.M è in grado di valutare la presenza di Brettanomyces spp. nell’aria attraverso l’uso della tecnologia  “SAS, Surface Air System” capace di campionare attivamente volumi noti di aria che vengono inviati direttamente sulla superficie del terreno di coltura specifico.

Poiché le tecniche coltura-dipendenti per la conta di Brettanomyces spp. possono richiedere fino a 8-10 giorni, appare di notevole interesse l’applicazione di metodi rapidi che consentono di monitorare la presenza di Brettanomyces in modo da poter intervenire tempestivamente per il ripristino delle condizioni ottimali di processo.

Lo sviluppo di tecniche di PCR e l’incremento esponenziale in database di sequenze di DNA, che permettono di disegnare sonde sempre più specifiche, hanno guidato il perfezionamento di sistemi coltura-indipendenti per la quantificazione dei microrganismi. Per ottenere risultati attendibili da un processo basato su sistemi coltura-indipendenti è, senza dubbio, necessario disporre di un buon protocollo di estrazione del DNA.
Il laboratorio analisi C.A.I.M. ha sviluppato metodi che permettono di estrarre il DNA direttamente dalla matrice vino e contemporaneamente ridurre notevolmente la presenza di possibili inibitori della PCR impiegata nella fase successiva dell’estrazione. La determinazione della specie di lievito Brettanomyces bruxellensis avviene mediante Real-Time PCR con applicazione quantitativa (qPCR). In particolare, la tecnica permette di amplificare una specifica sequenza di DNA e di monitorare la reazione di PCR acquisendo, ad intervalli regolari, un segnale emesso da marcatori fluorescenti, il cui accumulo segue la stessa cinetica di reazione. La fluorescenza rilevata a ciascun ciclo di amplificazione viene riportata in grafico in funzione del numero di cicli di PCR la cui fluorescenza sarà proporzionale al numero di copie di DNA amplificato ad ogni ciclo e, quindi, al numero di copie di partenza. La quantificazione avviene mediante la costruzione di una curva standard con quantità note della sequenza target da quantificare. La scelta dell’analisi in qPCR permette di ottenere risultati rapidi, in meno di 3 ore, e sensibili per il monitoraggio e la quantificazione del lievito.