Micotossine

Le Micotossine sono metaboliti secondari con attività tossica (anche cancerogena) sull’uomo e sugli animali prodotti in particolari condizioni microclimatiche da funghi meglio noti come “muffe”. Solo alcune specie di microrganismi (ad oggi circa 300) possono attivare vie metaboliche che conducono alla sintesi di Micotossine; la maggior parte di essi appartengono ai generi Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps, Alternaria, Cladosporium e Rhizopus.

Le Micotossine hanno molti effetti biologici diversi a causa della loro capacità di interagire con diversi sistemi bersaglio; sono classificate in epatotossine, immunotossine, dermatossine, nefrotossine e neurotossine. Sulla base del loro effetto cronico sono classificate in cancerogene, mutagene e teratogene.

Le Micotossine, essendo prodotte da specie diverse o da ceppi diversi della stessa specie fungina, hanno strutture chimiche diverse ma si possono riunire in gruppi di composti simili: Aflatossine (prodotte soprattutto dall’Aspergillus), Zearalenone e Deossinivalenolo (prodotti da Fusarium) e Ocratossina (prodotte da Penicillium).

Le derrate alimentari ed i mangimi sono i substrati ideali per lo sviluppo dei funghi produttori di Micotossine: formazioni pulverulente bianche, verdastre o nere su cereali, frutta secca e mangimi (ad esempio foraggi, insilati e farine) possono indicare la contaminazione del composto con Micotossine. Le tossine possono persistere per lungo tempo anche dopo l’eliminazione del fungo. L’assenza di ceppi fungini negli alimenti non indica pertanto necessariamente l’assenza di Micotossine.

Pannocchia di Mais contaminata da Funghi

Tutti i cereali (ad esempio frumento, mais, orzo, avena, segale), i semi oleaginosi (ad esempio arachidi e girasole), la frutta secca o essiccata (ad esempio mandorle, noci, nocciole, fichi secchi), i semi di cacao e caffè e le spezie (ad esempio peperoncino, pepe e zenzero) sono suscettibili di contaminazione da Micotossine. Anche prodotti derivati da queste materie prime, come le farine, possono contenere Micotossine.

Le muffe sono praticamente ubiquitarie, possono cioè vivere in molti tipi di ambienti anche se prediligono temperature e umidità elevate. Lo sviluppo di funghi e la formazione di Micotossine sono possibili sia quando una pianta coltivata si trova in campo che nelle successive fasi di trasporto, lavorazione e stoccaggio.

Mentre la sintesi di Aflatossine e Ocratossine avviene sia durante la coltivazione che nello stoccaggio del prodotto (anche in zone relativamente fredde), quella dello Zearalenone avviene essenzialmente durante la fase di coltivazione.

Le Micotossine possono provocare gravi danni economici negli allevamenti dovuti ad un calo nelle fasi produttive e riproduttive del bestiame. La contaminazione di prodotti di origine animale, come il latte, con Aflatossina M1 a livelli superiori a quelli previsti dalla legislazione vigente, obbliga alla distruzione dell’alimento contaminato.

Le Micotossine possono entrare nell’alimentazione umana sia direttamente, attraverso il consumo di alimenti vegetali contaminati, che indirettamente; in quest’ultimo caso l’uomo può consumare prodotti di origina animale (ad esempio carne, uova, latte, formaggio) contaminati da bestiame che ha ingerito mangime contaminato.

Le micotossicosi, sindromi tossiche derivanti dall’esposizione a micotossine, sono note fin dal 1800; l’ergotismo ad esempio, una patologia caratterizzata da necrosi degli arti, è causata dall’ingestione di grano contaminato da Claviceps purpurea. Nell’uomo e negli animali causano effetti tossici di natura ed entità variabili a seconda del modo, della dose e della frequenza di esposizione.

Il laboratorio di analisi C.A.I.M. ha acquisito notevole esperienza nella determinazione di Micotossine in alimenti e mangimi: si occupa da anni della loro determinazione nel latte, nei cereali e negli alimenti ad uso zootecnico come sostegno agli allevatori ed ai produttori di latte.

L’incremento di campioni positivi alle Micotossine rispetto nel corso degli anni (con livelli anche sostanziali) all’interno dell’Unione Europea (soprattutto in substrati importati da aree tropicali, subtropicali, paesi del nord Europa e USA) e la continua ricerca da parte dell’utenza di informazioni sull’azione di tale sostanze e sulla loro dose tossicologica ha comportato una richiesta sempre maggiore di tali analisi.

Per questi motivi il laboratorio di analisi C.A.I.M. ha deciso di utilizzare e accreditare metodi analitici riconosciuti a livello internazionale (metodi ISO e UNI) per la determinazione di Aflatossina M1 nel latte, Aflatossina B1, B2, G1 e G2, Ocratossina A (OTA A), Zearalenone (ZEA) e Deossinivalenolo (DON) in mangimi, cereali e prodotti derivati e alimenti a base cereali per lattanti e prima infanzia.

Il laboratorio C.A.I.M. è in grado di fornire i risultati dell’analisi dell’Aflatossina M1 nel latte in 24 ore. Il laboratorio è inoltre in grado di fornire i risultati dell’analisi delle altre Micotossine in 24 – 48 ore.

Le Aflatossine, particolarmente diffuse e tossiche, sono un gruppo di tossine prodotte da funghi appartenenti alla classe degli Ascomiceti, genere Aspergillus, in particolare A. flavus, A. parasiticus e A. nomius. Furono scoperte nel 1960 in seguito ad una intossicazione che colpì il settore avicolo in Inghilterra dove morirono più di 100.000 tacchini. Chimicamente sono derivati difuranocumarinici a basso peso molecolare (< 500 uma) ed elevata termostabilità (fino a 250°C).

Fra le Aflatossine finora isolate cinque sono rilevanti sia per diffusione che per tossicità:

• Aflatossina B1
• Aflatossina B2
• Aflatossina G1
• Aflatossina G2
• Aflatossina M1

Le Aflatossine appartenenti ai gruppi B e G sono prodotte nelle materie prime mentre l’Aflatossina M1 è un prodotto di idrossilazione metabolica dell’Aflatossina B1 e la lettera M è l’iniziale del prodotto idrossilato che viene trovato nel latte (Milk).

Le Aflatossine del gruppo B sono bifuranocumarine fuse con un anello ciclopentenonico, quelle del gruppo G sono bifuranocumarine fuse con un anello d-lattonico. Le lettere B e G corrispondono al tipo di fluorescenza che queste Micotossine emettono se irradiate con luce ultravioletta di 360 nm (Blue o Green).

La produzione di Aflatossine B e G è legata alla contemporanea presenza di:

• Ceppi tossigeni
• Condizioni ambientali idonee
• Squilibrio nutrizionale-ambientale.

Generalmente la Aflatossine si sviluppano su materie prime ricche in carboidrati; oltre al substrato ci sono fattori fisici che influenzano la produzione di Aflatossine: temperatura, umidità, luce e grado di aerazione.

La temperatura ottimale dipende dal substrato; in mezzo liquido la temperatura ottimale per A. flavus è 25°C e per A. parasiticus varia tra 26 e 34°C; la produzione di Aflatossine si blocca sotto i 13°C e al di sopra di 42°C.

L’umidità relativa al di sopra della quale le Aflatossine si sviluppano significativamente è dell’80%; la quantità di Aflatossine prodotte aumenta all’aumentare dell’umidità.

Il grado di aerazione è un fattore importante perché sia la crescita fungina che la produzione di Aflatossine sono processi aerobi.

Lo sviluppo contemporaneo sullo stesso substrato di più specie fungine e microflora competitiva riduce la produzione di micotossine.

Le condizioni meteoclimantiche che favoriscono la produzione di Aflatossine sono:

• Clima caratterizzato da temperatura elevata seguito da un forte calo termico (giornate calde e notti fredde o temporali);
• Stagioni con temperature superiori alla media e piovosità inferiore alla media;
• Presenza di insetti che veicolano le spore fungine e contemporaneamente danneggiano la pianta aumentando la superficie esposta all’attacco fungino.

Alle latitudini della penisola italiana la contaminazione dei substrati avviene principalmente in magazzino visto che i funghi del genere Aspergillus sono in grado di tollerare i bassi livelli di umidità delle granaglie nei depositi.

Gli Zearalenoni sono prodotti da diverse specie di Fusarium.
Lo Zearalenone è un lattone dell’acido resorcilico non dotato di tossicità acuta.

I substrati più adatti allo sviluppo delle specie fungine produttrici di Zearalenone e Deossinivalenolo sono mais, frumento, sorgo, orzo e avena.

Bovini e suini sono le specie animali più sensibili all’azione della tossina già a partire da concentrazioni di Zearalenone o Deossinivalenolo nella razione alimentare di 10 µg/Kg; può causare iperestrogenismo, ridotta assunzione di alimenti e produzione di latte, blocco dell’ovulazione e ninfomanie. Dati recenti indicano attività cancerogena. Il Deossinivalenolo, vista l’inappetenza e la scarsa ritenzione del cibo che causa nel bestiame, è conosciuto anche come Vomitossina.

Le Ocratossine sono un gruppo di metaboliti prodotti da funghi del genere Aspergillus e Penicillium, in particolare da A. ochraceus e da P. viridicatum.

Tra i prodotti che vengono frequentemente trovati contaminati ci sono l’orzo, il sorgo, il mais, il caffè crudo ed i mangimi.

L’Ocratossina A (OTA A), costituita da un derivato cumarinico legato alla fenilalanina, è quella più tossica. In particolare la sua biotrasformazione nell’uomo e negli animali porta alla formazione di intermedi metabolicamente responsabili dell’azione cancerogena e di altri effetti tossici.

I rischi derivanti dall’ingestione di prodotti contaminati da Micotossine hanno indotto numerosi Paesi a imporre misure atte al controllo delle derrate alimentari visto che i dati tossicologici indicano una tolleranza pressoché nulla per le Aflatossine. Le Aflatossine dovrebbero essere assenti da tutti gli alimenti destinati all’alimentazione umana e animale ma, essendo contaminanti naturali, è impossibile eliminare completamente il rischio di esposizione.

La legislazione in materia non può che ritenere tollerabile un certo grado di esposizione. L’orientamento delle autorità per stabilire i limiti massimi tollerabili dei cancerogeni diretti di origine naturale presenti negli alimenti segue il principio ALARA (“As Low As Reasonably Achievable”, basso per quanto ragionevolmente raggiungibile). Per questo la legislazione dell’Unione Europea definisce i tenori di Micotossina al livello più basso ragionevolmente conseguibile seguendo le raccomandazioni necessarie in materia di agricoltura, trasporto, stoccaggio e lavorazione delle materie prime.

Ad esempio, da quanto noto sul metabolismo delle Aflatossine appare evidente che la regolamentazione dei livelli massimi tollerabili di Aflatossina M1 nel latte e nei derivati non può prescindere dai valori definiti per l’Aflatossina B1 nei mangimi destinati alle lattifere.

Il quadro normativa dell’Unione Europea tutela i consumatori:

• Definendo i livelli massimi di Micotossine in determinati alimenti per garantire che non siano tossici per la salute umana
• Definendo i livelli massimi di Micotossine nei mangimi per garantire che non siano tossici per gli animali

Le disposizioni relative ai metodi di campionamento e analisi per il controllo dei tenori di Micotossine sono stabiliti nel Reg. CE 401/2006 GU CEE L 70/12 09/03/2006 e successive modifiche.

I tenori massimi di Micotossine negli alimenti sono definite nel Reg. CE 1881/2006 GU CEE L 364/5 20/12/2006 e successive modifiche. Nelle seguenti tabelle, a titolo di esempio, sono riportati alcuni alimenti con i rispettivi limiti legislativi proprio di ogni Micotossina.

I tenori massimi di Micotossine nei mangimi sono definiti nella Direttiva 2002/32/CE e successive modifiche e nella Raccomandazione 2006/576/CE e successive modifiche.

I metodi di analisi atti all’ispezione degli alimenti devono essere sensibili, ripetibili e riproducibili. È fondamentale tenere presente la distribuzione non omogenea delle Aflatossine B e G nel substrato contaminato; per questo è difficile ottenere un campione rappresentativo su cui effettuare la determinazione delle Micotossine.

Le disposizioni relative ai metodi di campionamento e analisi per il controllo dei tenori di Micotossine sono stabiliti nel Reg. CE 401/2006 GU CEE L 70/12 09/03/2006 e successive modifiche.

Il laboratorio C.A.I.M. ha accreditato metodi analitici conformi a quanto stabilito nel Reg. CE 401/2006 per la determinazione delle Micotossine in alimenti e mangimi.

I metodi accreditati dal laboratorio C.A.I.M. utilizzano la tecnica HPLC (“High Performance Liquid Chromatography”, cromatografia liquida ad alta prestazione) associata a detector FLD (“Fluorescence Detectors”, detector a fluorescenza) o DAD (“diode array detector”, detector UV-Visibile).

Questa tecnica analitica è l’unica in grado di quantificare le Micotossine eventualmente presenti nelle diverse matrici per valutare la conformità o meno della derrata alimentare ai limiti previsti dalla legislazione vigente.

Il laboratorio C.A.I.M. utilizza metodi analitici riconosciuti a livello internazionale (metodi ISO e UNI) per la determinazione di Aflatossina M1 nel latte, Aflatossina B1, B2, G1 e G2, Ocratossina A (OTA A), Zearalenone (ZEA) e Deossinivalenolo (DON) in mangimi, cereali e prodotti derivati e alimenti a base cereali per lattanti e prima infanzia.

Le Micotossine vengono estratte dal campione in esame e purificate mediante colonne di immunoaffinità che contengono anticorpi monoclonali specifici per la tossina di interesse. Nella colonna avviene il legame tra l’anticorpo e la tossina. Successivamente la colonna viene lavata per rimuovere tutte le componenti estranee e la tossina viene rilasciata dall’anticorpo a seguito dell’applicazione della soluzione di eluizione. L’eluato è iniettato in HPLC. Un tecnico di laboratorio esperto valuta il risultato, detto cromatogramma, di ogni analisi effettuata.

Per vedere l’elenco delle prove accreditate dal laboratorio C.A.I.M. consultare l’elenco prove disponibile QUI.

Il laboratorio C.A.I.M. è in grado di fornire i risultati dell’analisi dell’Aflatossina M1 nel latte in 24 ore.
Il laboratorio è inoltre in grado di fornire i risultati dell’analisi delle altre Micotossine in 24/48 ore.

Il laboratorio C.A.I.M. ha accreditato metodi di screening rapido per la determinazione di Aflatossina M1 nel latte. Questi metodi utilizzano la tecnica ELISA (“enzyme-linked immunosorbent assay”, saggio immuno-assorbente legato ad un enzima) e permettono di determinare il contenuto di Aflatossina M1 nel latte rapidamente ed economicamente. Questo consente agli allevatori e ai produttori di latte di poter implementare piani di autocontrollo atti a monitorare l’eventuale presenza di Aflatossina M1 nel prodotto finito prima che la sua concentrazione superi i limiti legislativi.

Questi metodi permettono di monitorare un gran numero di campioni in tempi brevi con costi contenuti; tuttavia sono poco sensibili e specifici. La possibilità di falsi positivi o falsi negativi non è trascurabile.

Per questi motivi quando si utilizza la tecnica ELISA:

• Se il contenuto di Aflatossina M1 nel latte risulta prossimo a quello previsto dalla legislazione vigente è consigliabile confermare la concentrazione di M1 rilevata con tecnica ELISA mediante tecnica HPLC. La tecnica ufficiale HPLC permette di quantificare esattamente l’Aflatossina M1 nel campione in esame.
• Se il contenuto di Aflatossina M1 nel latte risulta superiore a quello previsto dalla legislazione vigente è obbligatorio confermare la sua concentrazione mediante tecnica HPLC.

Il saggio viene effettuato su micropiastra precedentemente adsorbita con anticorpi anti Aflatossina M1. Nella micropiastra si addizionano gli standard ed i campioni: durante una prima incubazione le molecole di Aflatossina M1 libere si legano ai siti di legame degli anticorpi anti-M1; successivamente, la micropiastra viene lavata e si effettua una seconda incubazione con il coniugato enzimatico aflatossina-HRP. Al termine della seconda incubazione si effettua una seconda fase di lavaggio.

Nel corso della successiva fase di sviluppo il coniugato enzimatico rimasto legato all’anticorpo viene rilevato mediante l’aggiunta di una soluzione di substrato cromogeno incolore; quest’ultimo viene convertito in un prodotto di reazione colorato dall’attività enzimatica del coniugato.

Dopo aver bloccato la reazione enzimatica l’assorbanza viene misurata con un fotometro per micropiastra (lettori ELISA). Il colore generatosi sarà inversamente proporzionale alla concentrazione di Aflatossina M1 contenuto nel campione o nelle soluzioni standard.

Il laboratorio C.A.I.M. è in grado di fornire i risultati dell’analisi dell’Aflatossina M1 nel latte in 24 ore.